ArcticZymes—中等溫度失活核酸酶

ArcticZymes是一家致力于從寒冷深海物種種提取耐寒生化試劑用于分子生物學(xué)及診斷試劑研究的高科技公司，并且是該領(lǐng)域的。該公司始于于上世紀(jì)八十年代，zui初的目的是深入開發(fā)挪威北部漁業(yè)副產(chǎn)品的。九十年代中因應(yīng)生物工程技術(shù)的需要，ArcticZymes開始研發(fā)及生產(chǎn)北部寒冷深海物種為原料的堿性磷酸酶。2009 年ArcticZymes公司正式成立，提供以耐寒酶類為特色的各種分子生物學(xué)研究及診斷試劑研發(fā)的多款試劑，適應(yīng)于PCR及RNA提取等各種條件下DNA清除，復(fù)雜條件下酶促反應(yīng)（高鹽、低溫等）。

ArcticZymes公司產(chǎn)品與應(yīng)用：

一、PCR實(shí)驗(yàn)去污試劑盒

1、概述：作為高度靈敏的核酸檢測方法，PCR實(shí)驗(yàn)（特別是qPCR）非常容易受到各種污染，如含有大腸桿菌DNA的 PCR聚合酶，樣本中細(xì)菌DNA，以及dNTP、緩沖體系與引物中的污染。這些雜DNA的污染直接導(dǎo)致靈敏度的減少、假陽性等錯誤結(jié)果的出現(xiàn)。方法非常敏感細(xì)菌的DNA污染和細(xì)菌DNA的痕跡都可以在主人的混合和聚合酶。當(dāng)使用qPCR檢測或量化的少量的細(xì)菌DNA,污染E。桿菌DNA可能造成假陽性的結(jié)果。因此清除這些雜DNA對于獲得的PCR/qPCR結(jié)果尤為重要。ArcticZymes公司的PCR實(shí)驗(yàn)去污試劑盒專門設(shè)計(jì)為清除PCR預(yù)混體系中的污染DNA成分，不影響PCR的靈敏度。

2、產(chǎn)品優(yōu)勢：

*的雙鏈dsDNase可在引物及探針存在的情況下清除污染DNA；

有效適用于終點(diǎn)法PCR實(shí)驗(yàn)、以及基于探針和SYBR的qPCR體系；

可*將污染的細(xì)菌DNA清除至檢測閾值之下；

不影響PCR檢測的靈敏度（即使在痕量靶DNA檢測的情況下）；

操作便捷；

3、使用說明

a、將預(yù)混體系、引物或探針與試劑盒混勻；

b、37?C孵育20分鐘；

c、60?C dsDNase酶失活20分鐘（在試劑盒提供的DTT存在的前提下，dsDNase被不可逆失活，可確保后續(xù)PCR實(shí)驗(yàn)中模板的穩(wěn)定性）；

d、添加DNA模板，運(yùn)行qPCR實(shí)驗(yàn)。

4、商品規(guī)格：100/500time（預(yù)訂為20ul體系，可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)相應(yīng)調(diào)整用量）

二、Heat&Run gDNA 清除試劑盒

1、概述：在RT-PCR實(shí)驗(yàn)中，提取的RNA中容易混有基因組DNA,顯著影響隨后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，該試劑盒專設(shè)計(jì)為反轉(zhuǎn)錄之前清除RNA中的基因組DNA（gDNA）。

2、產(chǎn)品優(yōu)勢：

該試劑盒依靠重組的不耐熱dsDNase，該酶可在較低溫度下（58oC）即可不可逆失活，這種溫和條件就確保了RNA不受影響；

清除及反轉(zhuǎn)錄步驟可同管完成，zui大程度減少了誤差，節(jié)省時間。

3、使用說明：將試劑盒試劑直接添加在RNA樣本中，與反轉(zhuǎn)步驟同步進(jìn)行，適用于高通量實(shí)驗(yàn)。

4、商品規(guī)格：50/250 time

相關(guān)參考文獻(xiàn)

1.                  Comparative Analysis of Stress Induced Gene Expression in Caenorhabditis elegans following Exposure to Environmental and Lab Reconstituted Complex Metal Mixture
Kumar R, Pradhan A, Khan FA, Lindstr?m P, Ragnvaldsson D, Ivarsson P, et al. (2015). PLoS ONE 10(7): e0132896. doi:10.1371/journal.pone.0132896

2.                  Multi-platform assessment of transcriptome profiling using RNA-seq in the ABRF next-generation sequencing study
Nature Biotechnology 32, 915–925 (2014) doi:10.1038/nbt.2972
Received 14 May 2013 Accepted 01 July 2014 Published online 24 August 2014

三、雙鏈特異性DNA酶

1、概述：該款雙鏈特異的DNase提取自北極寒冷條件下的小蝦Pandalus borealis，具有*的雙鏈特異性，可在單鏈DNA分子如引物、探針的條件下清除PCR體系中的雙鏈污染DNA。

2、產(chǎn)品優(yōu)勢：

雙鏈特異的內(nèi)切特性活性；高酶活性；可在65°C的溫和條件下下孵育15分鐘失活；產(chǎn)物為5-磷酸寡核苷酸。

3、使用說明：見Heat&Run gDNA 清除試劑盒。

4、商品規(guī)格： 250 U/1000 U（Conc.: 2U/μl）, 2500 U （5U/μl）

四、HL-dsDNase

1、概述：HL-dsDNase是dsDNase的基因工程加工品，可在中等的溫度下（55°C，pH 大于 8.0）快速地*失活。可地適用于從RNA中清除DNA污染（可在鎂離子存在下）。

2、產(chǎn)品優(yōu)勢：雙鏈DNA內(nèi)切特異性，55度即可失活，高特異性。

3、使用說明：見Heat&Run gDNA 清除試劑盒，更適用于熱啟動RT酶的反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，在室溫時基因組DNA被清除，在熱啟動反轉(zhuǎn)錄時即失活該酶。

4、商品規(guī)格：250 U/1000 U（2U/μl），2500 U（5U/μl）

五、Cod Uracil-DNA Glycosylase

1、概述：Cod Uracil-DNA Glycosylase提取自大西洋鱈魚，是目前*一款可商業(yè)化采購的耐寒Uracil-DNA 轉(zhuǎn)葡糖基酶制品，可在溫和加熱條件下不可逆失活。適用于在PCR及q PCR實(shí)驗(yàn)中避免出現(xiàn)Carry-over（實(shí)驗(yàn)室其它PCR產(chǎn)物污染，如空氣、手套、槍頭、公用試劑、容器等）。目前避免Carry-over污染的有效措施是在PCR擴(kuò)增過程中用dUTP 取代dTTP，即在PCR擴(kuò)增前，PCR混合物用尿嘧啶DNA糖基酶（Uracil-DNA Glycosylase (UNG)）處理，在變性階段（堿性條件下）溫度升高至95°C，導(dǎo)致非嘧啶位點(diǎn)和carry-over DNA片段的斷裂 (如下圖)，而目標(biāo)模板因?yàn)楹行叵汆奏げ皇?/span>UNG處理的影響。

2、產(chǎn)品優(yōu)勢：

熱不穩(wěn)定性，55°C時*地不可逆失活，是目前*可與一步法RT-qPCR 兼容的UNG，且比減少實(shí)驗(yàn)靈敏度；

有效清除RT-PCR, RT-qPCR, qPCR及 kPCR實(shí)驗(yàn)中存在的Carry-over污染，且不降低靈敏度；

不可逆失活，不降解PCR產(chǎn)物，可繼續(xù)用于下一步實(shí)驗(yàn)（克隆或測序）

高純度，SDS-PAGE檢測，無污染的核苷酸或E. coli DNA；

單位酶活性（37°C時 1單位酶活每小時從含Uracil的DNA釋放1 nmol Uracil）；

高活性：: >500 000 Units/mg；

濃度：zui小至1 000 Units/ml；

高穩(wěn)定性：-20°C存放兩年，4°C存放 6 個月，可忍受多個冷凍-解凍循環(huán)。

3、使用說明：

A：用于常規(guī)PCR實(shí)驗(yàn)：

Cod UNG適用于所有商業(yè)化獲取的預(yù)混體系，請務(wù)必確認(rèn)您已經(jīng)在前期PCR實(shí)驗(yàn)中使用含有dUTP 的dNTP 混合物。

a、直接添加0.25 U Cod UNG至25 μl PCR反應(yīng)體系；

b、室溫孵育5 min；

c、運(yùn)行PCR循環(huán)。

-20°C or 4°C存儲PCR產(chǎn)物直至進(jìn)一步產(chǎn)物分析或應(yīng)用。

B、用于一步法RT-PCR

a、直接添加0.2 U Cod UNG至 20 μl RT-PCR反應(yīng)體系；

b、室溫孵育5 min；

c、反轉(zhuǎn)錄（50- 55°C）

d、運(yùn)行PCR循環(huán)。

4、商品規(guī)格：100 U/1000 U（1U/μl）、2500 U（5U/μl）

相關(guān)參考文獻(xiàn)：

1.                  Complex Species Status for Extinct Moa (Aves: Dinornithiformes) from the Genus EuryapteryxLeon Huynen and David M. Lambert* (2014)
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2.                  Highly Informative Ancient DNA ‘Snippets’ for New Zealand Moa
Jonathan McCallum,1 Samantha Hall,1 Iman Lissone,2 Jennifer Anderson,2 Leon Huynen,1 and David M. Lambert1,* (2013)PLoS One. 2013; 8(1): e50732. doi: 10.1371/journal.pone.0050732.

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9.                  Avoiding false positives with PCR.Kwok S., Higuchi R. (1989)Nature. 339: 237 – 238.

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11.              Quantitative assessment of the effect of uracil-DNA glycosylase on amplicon DNA degradation and RNA amplification in reverse transcription-PCR.Kleiboeker S.B. (2005)Virology Journal. 2: 29.

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六、Shrimp Alkaline Phosphatase

1、概述：堿性磷酸酶是基因克隆中去除空載體的理想試劑，然而常規(guī)堿性磷酸酶在該過程中冗長而易于出錯。而我公司的SAP因?yàn)榭稍诤唵蔚募訜崽幚砗?失活，并且適應(yīng)大多數(shù)限制性內(nèi)切酶的緩沖體系，可在酶切過程中通過直接添加SAP完成清除空載體的目的，而無需麻煩的計(jì)算及多步驟的孵育過程。Shrimp Alkaline Phosphatase （SAP）是ArcticZymes1993年首度從深海寒冷蝦中開發(fā)提提取的新型堿性磷酸酶, 2010獲得優(yōu)化重組的版本rSAP。因其便利而*的在較低溫度下*失活的性質(zhì)，無需在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行清除程序，該酶已成為目前zui的DNA修飾酶產(chǎn)品。

產(chǎn)品優(yōu)勢：

堿性磷酸酶金標(biāo)準(zhǔn)，市場上熱不穩(wěn)定性堿性磷酸酶；

高活性（>2 000 Units/mg）；

65°C 5分鐘，75°C 1分鐘即可*失活（PCR反應(yīng)中37°C到95°C然后回到37°C過程即可使之*失活）；

可從DNA/RNA/ dNTPs/蛋白中清除5-磷酸端，可直接添加至限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化處理，無需添加鋅離子或其它活性離子；

可在多種緩沖體系中使用；

易于在DNA測序或SNP分析前處理PCR產(chǎn)物中的未結(jié)合dNTPs；

高穩(wěn)定性（室溫保存90天后仍有超過95%的活性）；

單位酶活：在37oC，pH 10.4的甘氨酸緩沖液中，一單位SAP每分鐘可反應(yīng)1 μmol p-nitrophenyl phosphate，1單位SAP相當(dāng)于5到40單位Antarctic Phosphatase (New England Biolabs)，1.3 單位APex phosphatase，35單位NTPhos phosphatase (Epicentre)。

3、使用說明：

A、在含有限制性內(nèi)切酶的環(huán)境下（SAP用量：不少于0.1 U SAP/單位限制性內(nèi)切酶）

·                     1 μg質(zhì)粒

·                     5 Unit 限制性內(nèi)切酶

·                     5 μl 10x 限制性內(nèi)切酶緩沖液

·                     1 單位SAP

·                     加雙蒸水至50 μl

37°C孵育1小時, 失活處理，然后進(jìn)入連接步驟。

B、快速去磷酸化

在限制性剪切完成之后，簡單地直接加入5 U SAP/ μg載體， 37°C孵育5 min失活處理，然后進(jìn)入連接步驟。

4、商品規(guī)格：1000/5000 U。

相關(guān)參考文獻(xiàn)

應(yīng)用于克隆實(shí)驗(yàn)中去磷酸化

Generating In Vivo Cloning Vectors for Parallel Cloning of Large Gene Clusters by Homologous Recombination Jeongmin Lee, Eugene Rha, Soo-Jin Yeom, Dae-Hee Lee, Eui-Sung Choi and Seung-Goo Lee* (2013) PLoS One. 2013; 8(11): e79979. doi: 10.1371/journal.pone.0079979

應(yīng)用于基因分析或測序前清除d NTP

1.                  Medium-throughput SNP genotyping using mass spectrometry: multiplex SNP genotyping using the iPLEX? Gold assay. Millis M.P. (2011) Methods Mol Biol. 700:61-76.

2.                  Highly multiplexed genotyping of thiopurine s-methyltransferase variants using MALD-TOF mass spectrometry: reliable genotyping in different ethnic groups. Schaeffeler E., Zanger U.M., Eichelbaum M., Asante-Poku S., Shin J.G., Schwab M. (2008) Clin Chem. 54(10): 1637-47. Epub.  Aug 7. 2008.

3.                  Dried reagents for multiplex genotyping by tag-array minisequencing to be used in microfluidic devices. Ahlford A., Kjeldsen B., Reimers J., Lundmark A., Romani M., Wolff A., Syv?nen A.C., Brivio M. (2010) Analyst. 135(9): 2377-85. Epub Jul 29. 2010.

4.                  Genotyping SNPs using a UV-photocleavable oligonucleotide in MALDI-TOF MS. Vallone P.M., Fahr K., Kostrzewa M. (2005) Methods Mol Biol. 297: 169-78.

5.                  A gel-free SNP genotyping method: bioluminometric assay coupled with modified primer extension reactions (BAMPER) directly from double-stranded PCR products. Zhou G.H., Shirakura H., Kamahori M., Okano K., Nagai K., Kambara H. (2004) Hum Mutat. ug. 24(2): 155-63.

6.                  G2 checkpoint in uterine cervical cancer with HPV 16 E6 according to p53 polymorphism and its screening value. Cho N.H., Lim S.Y., Kim Y.T., Kim D., Kim Y.S., Kim J.W. (2003) Gynecol Oncol. 90(1): 15-22.

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8.                  ExoSAP-IT? Affymetrix (previously USB) has for several years utilized SAP together with Exonuclease I (ExoSAP-ITTM), to offer a simple, fast and cost efficient way to purify PCR products before Sequencing and genotyping. When PCR amplification is complete, any dNTPs or primers remaining in the PCR mixture will interfere with downstream applications. ExoSAP-It removes these contaminants.

應(yīng)用于蛋白去磷酸化

1.                  Autophosphorylation activates Dictyosium myosin II heavy chain kinase A by providing a ligand for an allosteric binding site in the alpha-kinase domain.
Crawley S.W., Gharaei M.S., Ye Q., Yang Y., Raveh B., London N., Schueler-Furman O., Jia Z., C?té G.P. (2011) J Biol Chem. 286(4): 2607-16. Epub Nov 11. 2010.

2.                  A diurnally regulated dehydrin from Avicennia marina that shows nucleo-cytoplasmic localization and is phosphorylated by Casein kinase II in vitro.
Mehta P.A., Rebala K.C., Venkataraman G., Parida A. (2009) Plant Physiol Biochem. 47(8): 701-9. Epub Mar 28. 2009.

應(yīng)用于定量分析

1.                  Dephospho-CoA kinase provides a rapid and sensitive radiochemical assay for coenzyme A and its thioesters. Wadler C., Cronan J.E. (2007) Anal Biochem. 368(1): 17-23. Epub Jun 7. 2007.

2.                  A comparison of enzymatic digestion for the quantitation of an oligonucleotide by liquid chromatography-isotope dilution mass spectrometry. Donald C.E., Stokes P., O’Connor G., Woolford A.J. (2005) J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 817(2): 173-82.

應(yīng)用于焦磷酸測序

1.                  Method enabling pyrosequencing on double-stranded DNA. Nordstr?m T., Nourizad K., Ronaghi M., Nyrén P. (2000) Anal Biochem. 282(2): 186-93.

七、鹽活性核酸酶SAN

1、概述：為增加細(xì)胞裂解液中蛋白的穩(wěn)定洗，需要高鹽的提取液，因此清除蛋白中的雜DNA/ RNA 需要耐高鹽的核酸酶，Salt Active Nuclease (SAN)即是一款*的高鹽緩沖液中具有高活性的核酸酶產(chǎn)品，適用于在完善地保護(hù)蛋白的前提下清除蛋白緩沖體系中的核酸成分，可在純化蛋白/酶時清除核酸污染，同時可降低蛋白提取液的粘滯度。

降低蛋白裂解液粘滯度

2、產(chǎn)品優(yōu)勢：

非特異性核酸內(nèi)切酶活性；

高鹽環(huán)境(0.5 M NaCl)下表現(xiàn)出*的酶活；

在較低溫度時即可發(fā)揮作用(20% at 6oC)；

適應(yīng)較寬的pH范圍；

室溫下穩(wěn)定；

高活性400.000 Units/mg。

3、使用說明：如圖所示

Figure 1: Addition of salt leads to DNA dissociation from proteins, making it available for degradation by the highly active SAN.

注：添加SAN的量要根據(jù)蛋白提取物的種類、孵育時間及溫度確定，一般情況下為50-1000 U/ml。在降低細(xì)菌或細(xì)胞裂解液粘滯度時，如果含有NaCl 可減少SAN用量，如1000 U/ mL無NaCl裂解液 vs. 100 U/mL 含0.25 M NaCl裂解液。

4、商品規(guī)格：Pack size: 5000 /25000 U（25U/μl）

                       Properties

相關(guān)參考文獻(xiàn)

1.                  LitR Is a Repressor of syp Genes and Has a Temperature-Sensitive Regulatory Effect on Biofilm Formation and Colony Morphology in Vibrio(Aliivibrio) salmonicida Appl. Environ. Microbiol. September 2014 vol. 80 no. 17 5530-5541 Published ahead of print 27 June 2014, doi: 10.1128/AEM.01239-14

八、HL-SAN

見鹽活性核酸酶SAN

商品規(guī)格：25000 U（ 25U/μl）

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