arthusbio Ik00303說(shuō)明書

S-Adenosyl-L-Homocysteine (SAH) ELISA Kit 3

S-腺苷-L-同型半胱安酸（SAH）ELISA Kit3

目錄號(hào)Ik00303

包裝尺寸48測(cè)試

檢測(cè)范圍15.625 nM-2000 nM

目標(biāo)詳細(xì)信息

甲硫安酸是一種具有硫甲基的氨基酸，通過(guò)甲硫安酸腺苷轉(zhuǎn)移酶（EC 2.5.1.6）與ATP一起轉(zhuǎn)化為S-腺苷甲硫安酸（SAM）。SAM是50多種生物活性物質(zhì)（如DNA、RNA、蛋白質(zhì)、磷脂、激素和神經(jīng)傳遞物等）的甲基供體。甲基在甲基轉(zhuǎn)移酶作用下從SAM轉(zhuǎn)移后，形成S-腺苷高半胱安酸，去除腺苷后進(jìn)一步代謝為同型半胱安酸（Hcy）。同型半胱安酸通過(guò)N5甲基四氫葉酸甲基轉(zhuǎn)移酶（EC1.1.1.68）和輔酶維生素B12催化途徑從N5甲基四氫葉酸接受甲基代謝為甲硫安酸。這是蛋氨酸循環(huán)。甲基化指數(shù)定義為SAM和SAH的比率。甲基化指數(shù)是甲基化狀態(tài)和甲基化的更好標(biāo)記

能力。

SAH和Hcy將向關(guān)鍵生物分子提供甲基和從N-5甲基四氫葉酸中回收甲基的過(guò)程連接起來(lái)。蛛網(wǎng)膜下腔出血的水平將決定或反映蛋氨酸循環(huán)是否正常。因此，找到一種更好地量化它們的方法具有重要的實(shí)際意義。SAH升高可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，這與基因組甲基化水平有關(guān)。蛛網(wǎng)膜下腔出血可能是動(dòng)脈粥樣硬化的潛在生物標(biāo)志物。

該免疫分析試劑盒用于測(cè)量可溶性樣本中的SAH水平。

測(cè)定原理

這種直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）旨在測(cè)量樣品中S-腺苷-L-甲硫安酸（SAH）的水平。將與大分子共軛的SAH固定在微升板上。用移液管將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品移入井中，然后用HRP-

添加抗SAH的共軛抗體。樣品或標(biāo)準(zhǔn)品中的游離SAH分子與微滴度板表面上的固定化SAH競(jìng)爭(zhēng)抗體的結(jié)合位點(diǎn)。丟棄混合溶液并清洗每個(gè)孔后，添加TMB基質(zhì)溶液。底物溶液在HRP（辣根過(guò)氧化物酶）的作用下變藍(lán)，

停車后變?yōu)辄S色

添加溶液（酸）。顏色與樣品（或標(biāo)準(zhǔn)品）中的SAH量成反比。使用微板分光光度計(jì)在450nm處測(cè)量剩余溶液（OD450）的光密度?？梢酝ㄟ^(guò)標(biāo)準(zhǔn)生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本中的SAH水平。

樣品收集和儲(chǔ)存

1、樣品采集必須在4°C下進(jìn)行。必要時(shí)，通過(guò)離心去除沉淀，并盡快測(cè)試樣品或?qū)⑵鋬?chǔ)存在-20°C或以下。避免重復(fù)凍融循環(huán)。

2、避免NaN3，因?yàn)樗鼤?huì)使HRP失活。

程序

1、將所有試劑重新加熱至室溫，并充分混合。取出適當(dāng)數(shù)量的孔，將剩余的孔放回原來(lái)的密封袋中。密封并儲(chǔ)存在-20°C。

2、向每個(gè)孔中加入50ul樣品稀釋劑（空白孔）、標(biāo)準(zhǔn)品和樣品。

3、制備HRP抗體溶液：用HRP抗體稀釋液按1:250稀釋HRP抗體，一周內(nèi)用完。充分混合并儲(chǔ)存在黑暗中。準(zhǔn)備一周內(nèi)使用的適量。注：始終*離心HRP抗體瓶，以回收所有15-17ul HRP抗體。建議收集所有樣本，并在一周內(nèi)進(jìn)行1-3次實(shí)驗(yàn)，使用3.8ml HP抗體稀釋液，通過(guò)多次洗滌回收小瓶中的所有HRP抗體。

4.將50ul HRP結(jié)合抗體添加到空白wll的每個(gè)孔中。

5、將平板置于振蕩器上，搖動(dòng)一段時(shí)間，使試劑混合，然后用微孔板封閉劑密封平板。將平板在37°C下培養(yǎng)1小時(shí)。

6、小心剝離密封劑，并將剩余溶液丟棄在孔中。在每個(gè)孔中添加至少300ul洗滌液，并保持該狀態(tài)30秒，然后去除洗滌液。重復(fù)這些步驟3次以完成清洗過(guò)程?；蛘吒挠米詣?dòng)清洗機(jī)。

7、向每個(gè)孔中添加TMB基質(zhì)和100ul混合基質(zhì)。輕輕搖晃并密封盤子。將培養(yǎng)板在37°C下無(wú)光培養(yǎng)15分鐘。

8、在反應(yīng)結(jié)束時(shí)加入50ul停止溶液。

9.在15分鐘內(nèi)測(cè)量每個(gè)孔在450 nm波長(zhǎng)下的吸光度。根據(jù)空白井設(shè)置零。

數(shù)據(jù)處理

始終通過(guò)從測(cè)試孔的吸光度中減去空白孔450 nm（OD450）處的吸光度來(lái)清除背景。

每個(gè)孔（標(biāo)準(zhǔn)或樣品）的吸收率等于AASO，A是標(biāo)準(zhǔn)孔或樣品孔的平均吸光度，ASO是S0標(biāo)準(zhǔn)孔的平均吸光度。

創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：通過(guò)繪制每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品在y軸上的結(jié)合率與其在x軸上濃度的對(duì)數(shù)來(lái)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用二次多項(xiàng)式曲線擬合數(shù)據(jù)（r>0.99）。通過(guò)將樣品的結(jié)合速率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，可以計(jì)算樣品的SAH水平。如果樣品已稀釋，則乘以稀釋程度。

筆記

1、在未預(yù)熱或環(huán)境溫度低于20°C的情況下使用試劑和樣品可能會(huì)導(dǎo)致OD450讀數(shù)降低。

2、洗井后額外干燥可能會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生負(fù)面影響，例如標(biāo)準(zhǔn)曲線較差，重復(fù)性較差。為了避免這種情況，請(qǐng)?jiān)谇逑春罅⒓磮?zhí)行下一步。

3、充分混合溶液并*清洗，因?yàn)檫@些程序會(huì)影響分析。

4、用微板封閉劑密封板，孵育板時(shí)避光。

5、推薦使用標(biāo)準(zhǔn)和樣品的重復(fù)井，建議使用二次多項(xiàng)式進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合（R2>0.99）。

質(zhì)控瓶的檢測(cè)濃度應(yīng)在檢測(cè)范圍內(nèi)。

6、濃縮洗滌液可能形成晶體。將其加熱，使鹽在稀釋前*溶解。

7、每次使用后應(yīng)處理微孔板密封劑，以避免交叉污染。

HRP基板（TMB）應(yīng)保持在黑暗中。

9、停止溶液為稀硫酸。避免直接接觸皮膚和其他物品。

儲(chǔ)存和到期

儲(chǔ)存條件：除HRP基質(zhì)和停止溶液儲(chǔ)存在2-8°C外，所有其他成分和板條均可冷凍儲(chǔ)存。

有效期：自裝運(yùn)之日起冰箱儲(chǔ)存約6個(gè)月。如果不打算很快使用，用戶可以將分析板，

HRP抗SAM抗體、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP抗體和樣品稀釋液在冷凍柜中儲(chǔ)存更長(zhǎng)時(shí)間或/和更好的結(jié)果。