一旦目標(biāo)得到驗(yàn)證，就決定了所需的干預(yù)類型?？贵w藥物通常靶向細(xì)胞表面分子，例如細(xì)胞膜受體或腫瘤抗原。單克隆抗體藥物可以通過(guò)信號(hào)阻斷、免疫檢查點(diǎn)抑制或單克隆抗體內(nèi)化等多種作用機(jī)制發(fā)揮其治療作用。此時(shí)要考慮的另一個(gè)重要方面是選擇可以提供所需治療效果的抗體形式?？紤]了幾個(gè)參數(shù)，包括同種型（IgG、IgM 或 IgA）、人源化與*人、單價(jià)與多價(jià)、單特異性與雙特異性/多特異性、完整 Ig 與 Ab 片段、偶聯(lián)物與非偶聯(lián)物等。
早期的候選抗體被稱為“命中"，由使用雜交瘤技術(shù)、噬菌體展示或酵母展示平臺(tái)生成的 mAb 克隆產(chǎn)生。使用不同技術(shù)產(chǎn)生的治療性抗體候選者在成為最終臨床候選者之前通常會(huì)經(jīng)歷以下研發(fā)階段：
基于抗原結(jié)合能力的篩選
基于生物功能的命中表征和先導(dǎo)選擇
鉛優(yōu)化以增強(qiáng)安全性、有效性和可制造性之間的平衡
臨床候選人選擇
成功篩選 mAb 克隆需要高質(zhì)量的試劑和經(jīng)過(guò)充分驗(yàn)證的功能分析。用于檢測(cè)開(kāi)發(fā)的常用試劑是 cDNA、表達(dá)質(zhì)粒、細(xì)胞系、純化蛋白、對(duì)照和參考抗體，以及用于測(cè)試物種交叉反應(yīng)的目標(biāo)直系同源物。篩選試驗(yàn)通常包括初級(jí)、二級(jí)和三級(jí)試驗(yàn)。初步篩選測(cè)定，通常是 ELISA，用于識(shí)別命中并過(guò)濾掉與目標(biāo)靶標(biāo)結(jié)合的抗體。隨后，設(shè)計(jì)了二級(jí)測(cè)定（高通量）和三級(jí)測(cè)定（低通量）來(lái)評(píng)估候選抗體的所需生物活性。例如，假設(shè)目標(biāo)是識(shí)別阻斷特定配體受體信號(hào)通路的抗體。在這種情況下，基于板的配體/受體結(jié)合 ELISA 可用作二級(jí)測(cè)定，而具有信號(hào)讀數(shù)的基于細(xì)胞的配體/受體結(jié)合測(cè)定可用作三級(jí)測(cè)定。
在這個(gè)階段，參考抗體、陽(yáng)性對(duì)照抗體和陰性對(duì)照抗體的選擇至關(guān)重要，因?yàn)樗鼈冇兄谧龀鲇行У臎Q定。合適的參考抗體或陽(yáng)性對(duì)照抗體是檢測(cè)驗(yàn)證的重要工具。參考抗體可以是功能與預(yù)期治療候選物相似的市售單克隆抗體或從公共領(lǐng)域中可用的序列重建的抗體。參考抗體也用于體內(nèi)概念驗(yàn)證研究，以驗(yàn)證目標(biāo)或建立功效模型。同樣，用于檢測(cè)的陰性對(duì)照抗體也非常關(guān)鍵。用于基于細(xì)胞的功能測(cè)定和體內(nèi)的陰性對(duì)照 mAb功效研究必須是物種和同種型匹配的。
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先導(dǎo)選擇涉及嚴(yán)格的多步驟篩選過(guò)程，以選擇與預(yù)先確定的標(biāo)準(zhǔn)或關(guān)鍵質(zhì)量屬性(CQA) 相匹配的先導(dǎo)分子，以推進(jìn)藥物開(kāi)發(fā)的下一階段。首先，高級(jí)命中經(jīng)過(guò)小規(guī)模表達(dá)和純化，以進(jìn)行進(jìn)一步的評(píng)估和表征?？贵w表征包括結(jié)構(gòu)、生化、生物物理和功能特性。例如，分析旨在確定：
全抗體序列和表位/CDR
哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)水平
配體結(jié)合親和力
翻譯后修飾
蛋白質(zhì)聚集或碎裂
生物效應(yīng)功能（ADCC、ADCP、CDC）
在這個(gè)階段，不符合 CQA 標(biāo)準(zhǔn)的“命中"被消除（例如，次優(yōu)的靶標(biāo)結(jié)合親和力、缺乏 ADCC 功能或較差的生化和/或生物物理屬性）。在體外表征后，選擇的先導(dǎo)分子被表達(dá)和純化，用于初步的體內(nèi)功效測(cè)試。粗略的 PK/PD 和毒性研究可以與相關(guān)動(dòng)物模型中的功效研究一起進(jìn)行，以確認(rèn)先導(dǎo)選擇。
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選定的先導(dǎo)分子可能需要進(jìn)一步的分子工程，以最大限度地提高治療效果和安全性，最大限度地降低免疫原性/毒性，并提高可制造性以成為最終的臨床候選者。該過(guò)程包括：
抗體人源化
新一代治療性抗體是具有低免疫原性的人源化或全人 Ig 序列。這意味著它們與人類 Ig 序列更相似，因此會(huì)在患者體內(nèi)誘導(dǎo)低抗藥物抗體 (ADA)反應(yīng)，這可能會(huì)影響治療效果。例如，在嚙齒動(dòng)物抗體（通過(guò)雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生）的情況下，>90% 的 IgG 序列被人 IgG 序列取代。計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)、噬菌體展示和酵母展示是廣泛使用的抗體人源化方法。使用的一些流行軟件是 BioLuminate、MOE 和網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器 Tabhu（抗體人源化工具）
去免疫和耐受
其他因素，如表位序列、聚集、劑量、給藥途徑和靶點(diǎn)也可能有助于治療性抗體的免疫原性。去免疫是消除可引起免疫反應(yīng)的抗原性表位，即T細(xì)胞、B細(xì)胞和MHC表位的過(guò)程。計(jì)算工具，例如來(lái)自 DNA 星的 Protean 3D，通常用于預(yù)測(cè)查詢序列中的這些表位。此外，一種降低免疫原性的新方法是將 Treg 表位引入抗體結(jié)構(gòu)中，以刺激 Treg 細(xì)胞。
親和力成熟
該過(guò)程涉及將配體結(jié)合親和力提高到所需的親和力范圍（通常為 0.1-10 nM）。例如，通常需要高結(jié)合親和力來(lái)阻斷受體信號(hào)級(jí)聯(lián)。此外，親和力成熟有助于減少與其他相關(guān)抗原的交叉反應(yīng)，從而減少脫靶毒性的機(jī)會(huì)。成熟技術(shù)包括隨機(jī)誘變、靶向誘變、鏈改組和計(jì)算機(jī)內(nèi)方法（例如，BioLuminate）。
Fc效應(yīng)器功能
抗體的 Fc 區(qū)可以引發(fā)免疫效應(yīng)功能，例如抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性 (ADCC)、抗體誘導(dǎo)的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性 (CDC) 和抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬作用 (ADCP)。通過(guò)計(jì)算機(jī)內(nèi)設(shè)計(jì)、定點(diǎn)誘變和糖基修飾進(jìn)行的 Fc 工程可改善效應(yīng)器功能，尤其是在癌癥治療中。相反，用于自身免疫性疾病和炎癥性疾病的抗體藥物需要 Fc 突變來(lái)禁用 Fc-FcγR 相互作用。
藥代動(dòng)力學(xué)特性
藥代動(dòng)力學(xué)改進(jìn)旨在增加血清半衰期（允許低劑量）、增加給藥間隔、開(kāi)發(fā)皮下制劑等。 Fc 區(qū)的特定突變已顯示降低非特異性清除（當(dāng)非特異性內(nèi)化到細(xì)胞內(nèi)體時(shí)）和抗原結(jié)合-介導(dǎo)的內(nèi)化和清除。例如，在中性 pH 條件下增加 Fc-FcRn 結(jié)合可使抗體免于降解。
藥物特性
理想的生物制劑必須具備高熱穩(wěn)定性、高溶解度、高化學(xué)穩(wěn)定性和低異質(zhì)性。這些特性共同確保了抗體在儲(chǔ)存過(guò)程中的生物活性的成功保留、最小的聚集、更高的產(chǎn)量、易于配制和改進(jìn)的制造質(zhì)量控制。
