phiphilux泛毒素

概述

泛毒素^™ 是 OncoImmunin,Inc. 新的基于活細胞的試劑盒，用于測量細胞毒性淋巴細胞打擊的致死物成功遞送到單個靶細胞。該試劑盒用于具有雙激光（488 和 633 nm）細胞計數(shù)能力的 80 次測定。（對于單激光系統(tǒng)，請聯(lián)系 OncoImmunin,Inc.直接。）

泛毒素^™ 與格蘭毒素^®加！和CyToxiLux^®加！、OncoImmunin,Inc. 的其他單細胞毒性檢測試劑盒，區(qū)別在于細胞滲透性、熒光底物：泛毒素^™ 含有可檢測兩者顆粒酶 B 和上游半胱天冬酶活性，而底物在格蘭毒素^® 旨在僅檢測顆粒酶 B 活性，并在CyToxiLux^® 下游半胱天冬酶活性。與其他兩個套件一樣，泛毒素^™ 可用于操作抗體的選擇通過an 抗體依賴性細胞毒性 (ADCC)低通量和高通量篩選 (HTS) 模式下的機制。

優(yōu)點泛毒素^™, 格蘭毒素^®和CyToxiLux^® 超過其他細胞毒性試驗，例如，⁵¹Cr 釋放、LDH 釋放和 PI 包括：(1) 細胞毒性作為導致細胞死亡（細胞滲透性熒光底物裂解）的基本生化途徑進行測定，而不僅僅是質(zhì)膜滲透性損失及其后遺癥，(2) 敏感性增強，可檢測到針對亞優(yōu)勢表位的相對較弱 CTL 反應 (3) 快速性（效應子：目標共孵育時間為 0.3-2 小時），(4) 可通過流式細胞術或熒光顯微鏡僅在靶細胞群中進行細胞死亡測定，(5) 結合免疫表型分析和多參數(shù)流式細胞術時，可直接觀察和監(jiān)測細胞毒性淋巴細胞介導的主要宿主靶細胞殺傷以及效應細胞的生理和命運。

靶細胞被熒光標記（紅色）然后在有熒光的情況下與細胞毒性效應細胞共孵育底物。孵育和清洗后，可通過流式細胞儀分析樣本。裂解底物  導致死亡細胞中綠色熒光增加。實時成像也可以用共聚焦顯微鏡進行。

請在開始試驗前閱讀整個方案！

組件供應泛毒素^™ 試劑盒（足夠用于 80 含量測定） 由以下機構提供的組件 使用者

小瓶 PS（4 瓶）=PanCyToxiLux^™ 底物 溶液 效應子 細胞

小瓶 TFL4（1 瓶）=靶細胞與雙激光儀器配合使用的標記物 TFL 稀釋介質(zhì)（1 個小 Eppendorf 管）= 重懸介質(zhì)

針對小瓶 TFL4

靶細胞

清洗緩沖液瓶（1 瓶）

為了從起始靶細胞群中消除非活細胞，例如，由于凍融循環(huán)，請聯(lián)系 OncoImmunin,Inc.請注意：用熒光探針標記細胞表面是不推薦，因為這可能干擾效應物-靶標相互作用。當按照本文中的程序使用時，TFL4 確實不標記細胞表面。

格式：可使用 96 孔板或聚丙烯微量離心管進行試驗。

TFL4 的復溶：從小 Eppendorf 管中取 25<unk>l 加入小瓶 TFL4。（復溶后，TFL4應儲存在-20^oC.)

中 T= 標記靶細胞的培養(yǎng)基。復溶溶液 1<unk>lTFL4加入靶細胞生長的培養(yǎng)基或生理緩沖液如磷酸鹽緩沖液 (PBS) 中。請注意：大多數(shù)細胞在 PBS 或不含血清的培養(yǎng)基中負荷更有效。如含 10% 血清，推薦TFL4稀釋度為 1:1000，而對于無血清緩沖液，靶細胞標記通常用于1:3000但是，進一步稀釋可能更優(yōu)。宜TFL4單個靶細胞類型的濃度應確定為 1:1000（含血清）和 1:3000（無血清培養(yǎng)基）僅為建議的起始點。

洗滌定義為加入體積的培養(yǎng)基/緩沖液，然后離心，然后小心移除試管中的所有液體或輕彈，然后輕輕夯實平板。應使用手指輕輕移液和/或輕敲試管，重懸微丸。請勿渦旋.

方案

制備靶細胞

1. 懸浮靶細胞（懸浮或胰蛋白酶化貼壁細胞）于中 T在 2 x 10⁶細胞/ml。（這是建議的濃度。可以并常規(guī)使用較低的數(shù)字。臨界點是能夠收集到 2,000-10,000  分析用靶細胞（見下文）。）如果要用增敏劑（如多肽）沖擊靶標，則應在此階段加入后者。（如果肽溶解度需要使用有機助溶劑，后者不應超過 0.3% (v/v)，且 溶媒

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應包括對照管/孔。）在 37 ℃ 下孵育^oC 下 0.25-1.0 小時。應確定單個細胞類型（和致敏劑）的宜時間。請注意：對于 PBL 的上樣，1:1000 稀釋TFL4在 37℃PBS 中 15'^o建議使用 C。如果要將多肽與靶標一起使用，建議是添加TFL4對于后 15’ 的致敏劑暴露。

1. 在此期間，制備效應細胞（見下文）。
2. 清洗靶細胞2 次，至少超出生理體積的 10 倍每次清洗的緩沖液/培養(yǎng)基.
3. 標示計數(shù)靶細胞。（此時必須對細胞進行計數(shù)，因為清洗時始終存在細胞損失。）重懸標記靶細胞在 1 x 10 下⁶細胞/ml清洗緩沖液。（根據(jù)實驗設計，較低濃度的靶細胞可使用。1 x 10⁶對于 1 x 10 的情況，建議使用 cells/ml⁵ 目標/孔或  管將為 使用。）
4. 分配 100<unk>l靶細胞混懸液加至各試驗孔或試管中。

效應細胞的制備

1.  制備適當濃度的效應細胞清洗緩沖液.   例如，對于終效應者目標比值  的 5:1，其中 1 x 10⁵ 目標/孔或管將使用，以 5 x 10 懸浮效應細胞⁶ 細胞/ml。

共孵育目標和效應細胞

1. 向各孔或含以下物質(zhì)的試管中加入 100<unk>l 效應細胞懸液靶細胞除外至少兩個孔，并加入 100

<unk>l 效應細胞懸液至至少兩個不含靶細胞.

1. 加入 100<unk>l清洗緩沖液至僅含目標且僅效應物使所有樣品達到終體積 200<unk>l.
2. 離心所有樣品，小心移除培養(yǎng)基，并將細胞團塊重懸于 75<unk>l 中底物來自小瓶 PSor 清洗緩沖液對于對照品（不存在底物（適用于以下管 A 和 C）。對于 ADCC，抗體應添加至  這次。
3. 重懸后，立即通過短暫離心沉淀細胞（一旦離心機達到細胞正常使用的速度，保持 30 秒，然后停止儀器。）
4. 在 37 ℃ 下孵育^oC 為所需時間點。由于該試驗檢測的是瀕死細胞，而不是具有不可逆損傷質(zhì)膜的細胞，因此給定細胞系統(tǒng)的孵育時間（以及 E:T）應顯著短于（和低于）其他方法。對于單個時間點測定，建議的共孵育時間為 1 小時（終端用戶時間通常在 30 min 至 2 小時之間）。相當長的時間不會 推薦。
5. 用 200<unk>l 清洗各樣品清洗緩沖液.
6. 重懸各樣品清洗緩沖液，如果使用酶標儀，轉(zhuǎn)移至流式細胞儀試管中或留在平板中，并通過流式細胞儀進行分析。

樣品總結：

1. 靶細胞（= 靶細胞 TFL4）
2. 靶細胞+ 底物來自小瓶 PS
3. 效應細胞
4. 效應細胞 +底物來自小瓶 PS
5. 靶細胞+ 效應細胞 +底物來自小瓶 PS（多個樣本）

流式細胞術：請勿渦旋。  (N.B.：由于本試驗測量的是致死打到靶細胞渦旋  強烈建議不要使用。）

應使用與以下激發(fā)和發(fā)射峰一致的通道設置：

TFL4l_ex: 633 nm, l_em: 657 nm

PS l_ex: 488 nm, l_em: 520 nm

對于為特定探針設置軟件的儀器：APC針對TFL4和FITC針對PS.

1. 在 FSC 點圖上（x 軸）vs. SSC（y 軸），位置靶細胞（樣本 A）位于右下方并抽取門控 1如下所示（此門控用于刪除無細胞事件）：

1. 使用樣品A 和D 初始設置APC（用于TFL4）和FITC（用于泛毒素^™）通道，resp.：放置樣品中細胞的峰值A 接近 10³在APC通道和樣品峰D at ca. 10¹在FITC通道。樣品 B 中的細胞應位于ca. 10³在APC和 10¹在FITC通道，如下所示。可通過樣品 B 的 PMT 小幅調(diào)整進行優(yōu)化（注：健康（臺盼藍拒染法顯示 > 95% 活性）TFL4-標記靶細胞應顯示為單一群體。如果不是，首先嘗試將貼標時間縮短至 15 min。如果仍存在一個以上的種群，則減少TFL4 濃度。）

運行剩余樣本。2,000-10,000靶細胞應采集每份樣本進行分析門 2（上圖和下圖）。門 2應嵌套在內(nèi)部門控 1。在以下 E:T (NK92:K562) 為 3:1 的示例中，能夠裂解 PanToxiLux 的靶細胞百分比^™底物is 70.3%。這與 4.8%靶細胞單獨的背景（如上圖所示）。請注意：使用 NFL1（OncoImmunin,Inc. 提供的探針）可顯著降低該背景。需要帶有 PacBlue 通道的細胞儀（激發(fā)ca. 405 nm 和發(fā)射ca. 465 nm).

參考文獻泛毒素™

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