k-assay大鼠肌酸激酶 MB 同工酶 (CKMB) ELISA
用于定量測定血清、血漿、組織勻漿、細(xì)胞裂解液、細(xì)胞培養(yǎng)中的大鼠 CKMB上清液和其他生物液體。
kamiya目錄號編號KT-12247
僅供研究使用。
產(chǎn)品信息
大鼠肌酸激酶 MB 同工酶 (CKMB) ELISA
目錄號編號KT-12247
預(yù)期用途
試劑盒是一種夾心酶免疫測定法，用于體外定量測定血清、血漿、組織勻漿、細(xì)胞裂解液、細(xì)胞培養(yǎng)上清液和其他生物體液中的大鼠 CKMB。僅供研究使用。
組件
試劑 | 數(shù)量 |
預(yù)包被，即用型 96 孔板條 | 1 |
校準(zhǔn)品 | 2 |
校準(zhǔn)品稀釋液 | 1 × 20 mL |
檢測試劑 A | 1 × 120 μL |
檢測試劑 B | 1 × 120 μL |
試驗稀釋劑 A | 1 × 12 mL |
試驗稀釋劑 B | 1 × 12 mL |
TMB 底物 | 1 × 9 mL |
終止液 | 1 × 6 mL |
清洗緩沖液（30X 濃縮液） | 1 × 20 mL |
96 孔封板覆膜 | 4 |
需要但未提供的材料
1. 帶有 450±10 nm 濾光片的酶標(biāo)儀。
2. 具有高精度和一次性槍頭的單道或多道移液器。
3. 微量離心管。
4. 去離子水或蒸餾水。
5. 吸水紙吸干微孔板。
6. 清洗液容器。
7. 0.01 mol/L（或 1x）磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS)，pH 7.0-7.2。
儲存
所有試劑均應(yīng)按照小瓶上的標(biāo)簽保存。校準(zhǔn)品、檢測試劑 A、檢測試劑 B 和 96 孔板條接收后應(yīng)在-20 ℃ 下儲存，其他板條應(yīng)在 4 ℃ 下儲存。未使用的板條應(yīng)保存在密封袋中，并提供干燥劑，以盡量減少暴露于潮濕空氣。開封的檢測試劑盒將在 1 個月內(nèi)保持穩(wěn)定，前提是按照上述方法儲存。
測試原理
本試劑盒中提供的微孔板已用 CKMB 特異性抗體預(yù)包被。然后用 CKMB 特異性生物素結(jié)合抗體將校準(zhǔn)品或樣本加入適當(dāng)?shù)奈⒖装蹇字?。然后，將偶?lián)辣根過氧化物酶 (HRP) 的抗生物素蛋白加入到每個微孔板小孔中并孵育。加入 TMB 底物溶液后，僅含 CKMB、生物素結(jié)合抗體和酶結(jié)合抗生物素蛋白的微孔顯示顏色變化。酶-底物反應(yīng)終止 by 的 添加 of 硫酸的 酸 溶液 和 的 顏色 變更 is 采用分光光度法在 450 nm±10 nm 波長處測定。然后通過比較樣本的 O.D. 與校準(zhǔn)曲線，測定樣本中 CKMB 的濃度。
樣本采集和儲存
使用血清分離管，使樣本在室溫下凝結(jié) 2 小時或在 4 °C 下過夜，然后以約 1,000 xg 離心 20 min。立即測定新鮮制備的血清或?qū)⒌确輼颖緝Υ嬖?20 °C 或-80 °C 下備用。避免反復(fù)凍融循環(huán)。
使用 EDTA 或肝素作為抗凝劑采集血漿。采集后 30 min 內(nèi)，在 4 ℃ 下以 1,000 xg 離心樣本 15 min。立即取出血漿并測定，或?qū)⒌确謽颖緝Υ嬖?20 °C 或-80 °C 備用。避免反復(fù)凍融循環(huán)。
組織勻漿的制備因組織類型而異。
1. 在冰冷 PBS 中沖洗組織，*除去過量血液，并在勻漿前稱重。
2. 將組織切成小塊，并在冰上用玻璃勻漿器（Micro tissue Grinders works，也是如此）在新鮮裂解緩沖液（需要根據(jù)目標(biāo)蛋白的亞細(xì)胞位置選擇不同的裂解緩沖液）（w:v = 1:20-1:50，例如在 20-50 mg 組織樣本中加入 1 mL 裂解緩沖液）中勻漿化。
3. 用超聲細(xì)胞破碎儀對所得混懸液進(jìn)行超聲處理，直至溶液澄清。
4. 然后，勻漿以 10,000×g 離心 5 min。立即收集上清液并進(jìn)行測定，或等分并在≤-20 ℃ 下儲存。
根據(jù)以下說明進(jìn)行測定前，需要裂解細(xì)胞。
1. 貼壁細(xì)胞應(yīng)用冷 PBS 輕輕洗滌，然后用胰蛋白酶分離，1 000 xg 離心 5 min 收集（懸浮細(xì)胞可直接離心收集）。
2. 在冷 PBS 中清洗細(xì)胞三次。
3. 在濃度為 10 的新鮮裂解緩沖液中重懸細(xì)胞7 細(xì)胞/mL。 If it is 必要， 的 細(xì)胞 可能是 接受 to 超聲處理 至 的 溶液 is 澄清。
4. 在 4 °C 下以 1,500 xg 離心 10 min，除去細(xì)胞碎片。立即測定或等分并在≤-20 ℃ 下儲存。
以 1,000 xg 離心樣品 20 min，立即收集上清液并進(jìn)行測定，或?qū)⒌确輼悠穬Υ嬖?20 °C 或-80 °C 備用。避免反復(fù)凍融循環(huán)。
注：
1. 5 天內(nèi)使用的樣品可在 4<unk>C 下儲存，否則樣品必須在-20<unk>C（≤1 個月）或-80<unk>C（≤2 個月）下儲存，以避免失去生物活性和污染。
2. 進(jìn)行試驗時，將樣品恢復(fù)至室溫。
3. 樣本溶血會影響結(jié)果，因此不應(yīng)使用溶血標(biāo)本。
4. 根據(jù)我們內(nèi)部數(shù)據(jù)量，強烈建議使用血清代替血漿進(jìn)行檢測。
試劑制備
使用前，將所有試劑盒組分和樣本恢復(fù)至室溫 (18-25 ℃)。如果試劑盒不能一次性用完，請只取出試紙條和試劑進(jìn)行現(xiàn)實驗，剩余試紙條和試劑留作所需條件。
用 1.0 mL 校準(zhǔn)品稀釋液復(fù)溶校準(zhǔn)品，室溫下放置 10 min，輕輕振搖（不得起泡）。儲備液中校準(zhǔn)品的濃度為 200 ng/mL。請先將原液稀釋至 100 ng/mL，稀釋后的校準(zhǔn)品作為高濃度校準(zhǔn)品 (100 ng/mL)。然后準(zhǔn)備 7 個含有 0.5 mL 校準(zhǔn)品稀釋液的試管，根據(jù)下圖，使用經(jīng)稀釋的校準(zhǔn)品制備雙倍稀釋系列。在下一次轉(zhuǎn)移前，充分混勻各試管。設(shè)置 7 個稀釋校準(zhǔn)品點，例如 100 ng/mL、50 ng/mL、25 ng/mL、12.5 ng/mL、6.25 ng/mL、3.12 ng/mL、1.56 ng/mL，后一個含有校準(zhǔn)品稀釋液的 EP 管為空白，濃度為 0 ng/mL。
 |
管路 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
ng/mL | 200 | 100 | 50 | 25 | 12.5 | 6.25 | 3.12 | 1.56 | 0 |
使用前短暫離心或離心儲備液檢測 A 和檢測 B。分別用試驗稀釋劑 A 和 B 將其稀釋至 100 倍工作濃度。
用 580 mL 去離子水或蒸餾水稀釋 20 mL 濃縮液 (30X)，制備 600 mL 清洗液 (1X)。
用無菌吸頭吸取所需劑量的溶液，不得將殘留溶液再次倒入小瓶中。
1. 在測定前 15 min 內(nèi)制備校準(zhǔn)品。請勿在 37 ℃ 下溶解試劑°C 直接。
2. 不允許在微孔中直接進(jìn)行連續(xù)稀釋。
3. 請按照說明仔細(xì)復(fù)溶校準(zhǔn)品或工作檢測試劑 A 和 B，避免起泡并輕輕混合，直至晶體*溶解。為盡量減少移液造成的不精密度，使用小體積并確保移液器經(jīng)過校準(zhǔn)。建議一次移液抽吸 10 μL 以上。
4. 重組校準(zhǔn)品、檢測試劑 A 和檢測試劑 B 只能使用一次。
5. 如果在清洗濃縮液 (30X) 中形成晶體，則加熱至室溫并輕輕混合，直至晶體*溶解。
6. 污染的水或試劑配制容器會影響檢測結(jié)果。
樣品制備
1. 我們僅對試劑盒本身負(fù)責(zé)，而不對測定過程中消耗的樣本負(fù)責(zé)。用戶應(yīng)計算整個檢測中可能使用的樣本量。請?zhí)崆邦A(yù)留足夠的樣本。
2. 請在測定前預(yù)測濃度。如果這些值不在校準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，則用戶必須確定其特定實驗的宜樣本稀釋度。應(yīng)使用 PBS 稀釋樣本。
3. 如果手冊中未指明樣本，則有必要進(jìn)行初步實驗以確定試劑盒的有效性。
4. 通過化學(xué)裂解緩沖液制備的組織或細(xì)胞提取樣本，由于某些化學(xué)物質(zhì)的影響，可能會導(dǎo)致意外的 ELISA 結(jié)果。
5. 由于其他來源的抗原和我們試劑盒中使用的抗體之間可能存在錯配（例如，抗體靶向構(gòu)象表位而不是線性表位），一些來自其他生產(chǎn)商的天然或重組蛋白可能無法被我們的產(chǎn)品識別。
6. 受細(xì)胞活力、細(xì)胞數(shù)量或取樣時間等因素影響，試劑盒可能無法對細(xì)胞培養(yǎng)上清液樣本進(jìn)行檢測。
7. 建議使用未經(jīng)長期儲存的新鮮樣本進(jìn)行試驗。否則，這些樣品可能發(fā)生蛋白質(zhì)降解和變性，終導(dǎo)致錯誤結(jié)果。
分析方法
1. 測定稀釋校準(zhǔn)品、空白和樣品的微孔。校準(zhǔn)品制備 7 孔，空白制備 1 孔。向適當(dāng)?shù)目字蟹謩e加入 100µL 校準(zhǔn)品稀釋液（讀取試劑制備）、空白和樣本。用封板覆膜覆蓋。在 37 ℃ 下孵育 1 小時。
2. 清除各孔中的液體，不要清洗。
3. 向各孔中加入 100µL 檢測試劑 A 工作液，用封板覆膜覆蓋孔，并在 37 ℃ 下孵育 1 小時。
4. 吸取該溶液，并使用噴霧瓶、多通道移液器、歧管分配器或自動洗滌器用 350µL 1X 清洗液清洗每個孔，并靜置 1-2 min。通過將微孔板卡在吸水紙上，*去除所有微孔中的剩余液體?？偣睬逑?3 次。后一次洗滌后，通過抽吸或傾倒除去任何剩余的洗滌緩沖液。倒置平板，在吸水紙上吸干。
5. 向各孔中加入 100µL 檢測試劑 B 工作液，用封板覆膜覆蓋孔，并在 37 ℃ 下孵育 30 min。
6. 按照步驟 4 重復(fù)抽吸/清洗過程共 5 次。
7. 向各孔中加入 90µL 底物溶液。用新封板覆膜覆蓋。在 37 ℃ 下孵育 10-20 min（不得超過 30 min）。避光保存。加入底物溶液后液體將變藍(lán)。
8. 向各孔中加入 50µL 終止液。加入終止液后，液體將變黃。輕敲微孔板側(cè)面，混合液體。如果顏色變化不均勻，輕輕敲擊平板以確保充分混合。
9. 取下平板底部的水滴和指紋，確認(rèn)液體表面無氣泡。然后運行酶標(biāo)儀，立即在 450 nm 處測定。
注：
1. 試驗準(zhǔn)備：每次實驗保留適當(dāng)數(shù)量的孔，并從微孔板中取出額外的孔。其余孔應(yīng)重新密封并儲存在-20 ℃ 下。
2. 樣本或試劑添加：請使用新鮮制備的校準(zhǔn)品。請小心地向孔中加入樣品并輕輕混合以避免起泡。請勿觸摸孔壁。對于程序中的每個步驟，向測定板中加入試劑或樣品的總分配時間不應(yīng)超過 10 min。這將確保每個移液步驟的運行時間相等，不會中斷。建議重復(fù)檢測所有校準(zhǔn)品和樣本，盡管不是必需的。為避免交叉污染，在添加校準(zhǔn)品、樣本和試劑之間更換移液器吸頭。此外，每種試劑使用單獨的儲液器。
3. 孵育：為確保結(jié)果準(zhǔn)確，孵育步驟期間必須適當(dāng)粘附封板覆膜。在孵育步驟之間，不得使孔長時間處于未覆蓋狀態(tài)。試劑加入微孔板條后，在測定過程中的任何時間都不要讓板條變干。必須控制孵育時間和溫度。
4. 清洗：清洗程序至關(guān)重要。在每個步驟中*去除液體對于良好性能至關(guān)重要。后一次洗滌后，通過抽吸或傾倒除去任何剩余的清洗液，并除去平板底部的任何水滴和指紋。清洗不充分將導(dǎo)致精密度較差和吸光度讀數(shù)假性升高。
5. 反應(yīng)時間的控制：觀察加入 TMB 底物后顏色的變化（如每 10 min 觀察一次），如顏色過深，應(yīng)提前加入終止液，避免反應(yīng)過強，導(dǎo)致吸光度讀數(shù)不準(zhǔn)確。
6. TMB 底物容易被污染。請避光保存。
7. 低于 60% 的環(huán)境濕度可能會對終性能產(chǎn)生一些影響，因此，建議在該條件下使用加濕器。
計算每個校準(zhǔn)品、質(zhì)控品和樣本的重復(fù)兩次讀數(shù)的平均值，并減去平均零校準(zhǔn)品光密度。通過繪制每份校準(zhǔn)品的平均 od 值和濃度，構(gòu)建校準(zhǔn)曲線，并通過該曲線圖上的點繪制適合擬合曲線，或在對數(shù)-對數(shù)曲線圖紙上以 CKMB 濃度為 y 軸，以吸光度為 x 軸，創(chuàng)建校準(zhǔn)曲線。還建議使用一些 plot 軟件。如果樣本已被稀釋，則從校準(zhǔn)曲線讀取的濃度必須乘以稀釋因子。
1.56–100 ng/mL。
用于 ELISA 的校準(zhǔn)曲線濃度為 100 ng/mL、50 ng/mL、25 ng/mL、12.5 ng/mL、6.25 ng/mL、3.12 ng/mL、1.56 ng/mL。
靈敏度
CKMB 的小可檢測劑量通常低于 0.67 ng/mL。
該試驗的靈敏度或檢測下限 (LLD) 定義為可與零區(qū)分的低蛋白濃度。通過將 20 次零校準(zhǔn)品重復(fù)測定的平均光密度值加上兩個標(biāo)準(zhǔn)差并計算相應(yīng)的濃度來確定。
該方法檢測 CKMB 具有較高的靈敏度和*的特異性。
1. 準(zhǔn)備好所有試劑、樣本和校準(zhǔn)品；
2. 向各微孔中加入 100 μL 校準(zhǔn)品或樣本。37 °C 下孵育 1 小時；
3. 吸出并加入 100 μL 制備的檢測試劑 A。在 37 ℃ 下孵育 1 小時；
4. 抽吸并清洗 3 次；
5. 加入 100 μL 制備好的檢測試劑 B，37 °C 孵育 30 min；
6. 抽吸并清洗 5 次；
7. 加入 90 μL 底物溶液。37 °C 下孵育 10-20 min；
8. 加入 50 μL 終止液。立即在 450 nm 處讀數(shù)。
1. 終實驗結(jié)果將與產(chǎn)品的有效性密切相關(guān)，因此試劑盒應(yīng)在失效日期前使用。請嚴(yán)格按照說明儲存試劑盒。
2. 不同批次試劑盒的檢測范圍、靈敏度和顯色時間可能略有不同。請嚴(yán)格按照試劑盒隨附說明書進(jìn)行實驗，本公司網(wǎng)站電子版僅供參考。
3. 請勿將不同批次試劑盒中的試劑混合或替代。僅使用制造商提供的試劑。
4. 儲存和孵育期間，所有試劑均應(yīng)避免強光照射。所有試劑瓶蓋均應(yīng)蓋緊，防止微生物的蒸發(fā)和污染。TMB 底物應(yīng)保持無色，直至與結(jié)合微孔板的酶反應(yīng)。
5. 首次開板時孔內(nèi)可能有一些霧狀物質(zhì)。對終試驗結(jié)果無任何影響。在需要之前，請勿從儲存袋中取出微孔板。
6. 試劑制備和加載過程中的錯誤操作，以及酶標(biāo)儀參數(shù)設(shè)置不正確可能導(dǎo)致結(jié)果不正確。帶寬為 10 nm 或更低，在 450±10 nm 波長下光密度范圍為 0-3 O.D. 的酶標(biāo)儀可用于吸光度測量。實驗前請仔細(xì)閱讀說明書并調(diào)整儀器。
7. 樣品制備和實驗操作的每個步驟的變化可能導(dǎo)致不同的結(jié)果。為了獲得更好的重現(xiàn)性結(jié)果，應(yīng)控制試驗中每個步驟的操作。
8. 每個套件均已嚴(yán)格通過 Q.C 測試。然而，由于一些非預(yù)期運輸條件或不同的實驗室設(shè)備，終端用戶的結(jié)果可能與我們的內(nèi)部數(shù)據(jù)不一致。不同批次試劑盒之間的試驗內(nèi)差異也可能由上述因素引起。
9. 來自不同制造商的具有相同項目的套件可能產(chǎn)生不同的結(jié)果，因為我們尚未將我們的產(chǎn)品與其他制造商進(jìn)行比較。
10. 用于抗體制備的試劑盒校準(zhǔn)品和免疫原通常為重組蛋白，由于重組蛋白制備中可能會用到不同的片段、表達(dá)系統(tǒng)、純化方法等，我們無法保證試劑盒能夠檢測到其他公司的重組蛋白。所以，不建議使用試劑盒進(jìn)行重組蛋白的檢測。
11. 請預(yù)測樣本中目標(biāo)分子的濃度，或者安排預(yù)實驗，是解決具體問題的好方法，例如樣本的濃度超出試劑盒的檢測范圍。
12. 由于其有效性的不確定性，該試劑盒可能不適用于檢測一些特殊實驗的樣本，例如基因敲除實驗。
13. 建議與該試劑盒一起使用的終止液是一種酸性溶液。使用本材料時，請佩戴眼睛、手、面部和防護(hù)服。
僅供研究使用。
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