zeptometrix  0801008說明書 

HIV-1 p24 Antigen ELISA 2.0

預期用途
retro-tek hiv-1 p24抗原Elisa 2.0是一種用于檢測人類免疫缺陷的酶聯(lián)免疫分析方法。
細胞培養(yǎng)基中的病毒1型（HIV-1）p24抗原。它可用于監(jiān)測
HIV-1或測定基于HIV-1的慢病毒樣本的滴度。因為p24的氨基酸序列在
不同的HIV-1分離株，本試驗檢測了來自HIV-1亞型a-f的p24。對人類沒有交叉反應(yīng)。
免疫缺陷病毒2型（HIV-2）、猴免疫缺陷病毒（SIV）或人類T細胞白血病病毒I型和II型
（htlv i和ii）p24或任何gag基因產(chǎn)物。
retro-tek hiv-1 p24抗原Elisa 2.0僅供研究使用。不用于診斷程序。
試驗原理
微孔板上覆蓋著一種單克隆抗體，該抗體對HIV-1的p24 gag基因產(chǎn)物具有特異性。HIV-1 p24抗原
在樣品培養(yǎng)期間，將樣品特別捕獲到固定抗體上。然后捕獲的抗原
與人抗HIV-1抗體結(jié)合辣根過氧化物酶（HRP）反應(yīng)。在隨后添加
底物，顏色隨著HRP酶的反應(yīng)而發(fā)展。合成的光密度與HIV-1 p24的量成正比。
樣本中存在抗原。然后繪制一組標準稀釋液的吸光度值。p24的量是
通過點到點圖的插值或標準曲線的線性回歸分析確定。
試劑
供應(yīng)材料：
•用于96次測定的HIV-1 p24抗體涂層微孔板，5個平板：12x8井條。涂有鼠藥的水井
抗HIV-1 p24的單克隆抗體。
•HIV-1 p24檢測抗體，5 x12 ml：含有HRP（辣根過氧化物酶）-與HIV-1結(jié)合的人抗體
從HIV-1人源材料中純化。
•HIV-1 p24抗原標準，5 x 0.5 ml：含有來自山羊HIV-1 IIIB的被破壞的、熱滅活的病毒抗原。
血清，Triton X-100®，疊氮化納。
•溶解緩沖液，5 x 5 ml:Triton X-100®在PBS和2-氯乙酰胺中。
測定稀釋劑，5×100毫升：含有山羊血清，PBS，Triton X-100®，和2-氯乙酰胺。
•10x洗板緩沖液，5 x 125 ml：含有PBS、Tween 20®和2-氯乙酰胺。
•基質(zhì)，5 x 12 ml：含有四甲基聯(lián)苯胺（TMB）。
•微孔板封閉劑（1 pk）：每包10個封閉劑
•停止溶液，5 x 12 ml：含有鹽酸（HCl）。
•封板劑：5 x10
•可再密封塑料袋：5個
？Triton X-100是Union Carbide Chemicals and Plastics Co.，Inc.的注冊商標。Tween 20是
帝國化學工業(yè)的商標。

存儲
將所有試劑盒儲存在2°-8°C的溫度下。不要冷凍。當正確存放時，該套件在包裝盒上注明的日期前是穩(wěn)定的。
標簽。
所需但未提供的材料：
•一次性手套
•經(jīng)驗證的可調(diào)節(jié)微量移液管，單通道和多通道
•用于制備樣品和控制稀釋的試管和試管架
•量筒和各種燒杯
•經(jīng)驗證的自動微孔板清洗機或手動真空抽吸設(shè)備
驗證培養(yǎng)箱溫度為37°C±1°C
•經(jīng)驗證的微孔板讀卡器
計時器
•1%次氯酸鈉作為消毒劑?？捎杉矣闷讋┲瞥?/span>
•蒸餾水或去離子水
注意事項
僅供研究使用。不用于體外診斷。
•進行分析前，仔細閱讀所有說明。
•使用通用預防措施處理套件組件和試樣。
•為避免交叉污染，對每個樣品使用單獨的吸管頭。
•當測試潛在感染性人體樣本時，遵守所有適用的地方、州和聯(lián)邦法規(guī)。
關(guān)于生物有害物質(zhì)的處理。
•HIV-1 p24抗原標準含有疊氮鈉作為防腐劑。疊氮化納可能與鉛或銅管發(fā)生反應(yīng)。
形成爆炸性的金屬疊氮化物。處理后用大量水沖洗管道，以防止疊氮化物在
排水溝。
•停止溶液含有鹽酸，可能導致嚴重燒傷。如果接觸到眼睛或皮膚，請沖洗
立即用水并尋求醫(yī)療救助。穿防護服和護目鏡。
•用于制造HIV-1檢測儀抗體的人源材料已經(jīng)過測試，結(jié)果為陰性。
乙型肝炎表面抗原。用于制備HIV-1 p24抗原標準的病毒裂解液已被
化學破壞和加熱。把這些試劑當作能傳播傳染源的試劑來處理。
•盡管p24抗原保存良好，但一些HIV-1分離株和重組克隆可能表現(xiàn)出輕微的反應(yīng)性。
與HIV-1 p24抗原標準相比的差異包括該試劑盒。

試劑的制備
•使用前將所有試劑置于室溫。
•洗板緩沖液：使用前，將10倍洗板緩沖液1:10在蒸餾水或去離子水中稀釋。1X洗板緩沖器
可在2°-8°C下儲存1周。10倍洗板緩沖液（目錄：0801060）的附加瓶可
命令。
•洗板：將洗板機或其他點膠設(shè)備的點膠量設(shè)置為至少350微升或高達
可能不會溢出微孔板。這將確保*洗井并防止?jié)撛诘?/span>
由移液管或板密封件拆卸過程中可能發(fā)生的試劑飛濺引起的信號背景。
•試驗準備：標記用于制備標準和樣品的試管。在每條帶子的末端貼上標簽
標簽，以確定試紙條在分析過程中是否與板架分離。如果整個96孔板
不要使用，從板架上取下多余的條帶。將多余的條帶和干燥劑放入可重新密封的塑料中
包裝、密封并在2°-8°C下儲存。
•HIV-1 p24抗原標準：根據(jù)HIV-1 p24抗原標準制備一系列六個標準。使用稀釋液
表1中的方案。在完成檢測后，任何稀釋的HIV-1 p24抗原標準都應(yīng)
丟棄的。

標準品不需要用溶解緩沖液處理。
•試樣：將50微升溶解緩沖液移液至450微升樣品中，在試管中處理樣品，并充分混合。
或者，只要樣品被1/10體積的溶解緩沖液破壞，就可以使用其他體積。未知的
樣品建議制備一套10倍稀釋液，以確保其中一種稀釋液符合標準。
曲線?？梢杂梅治鱿♂寗┗蚣毎囵B(yǎng)基稀釋。處理過的樣品可以長期保存在
-20℃或更低（如有必要） 

試驗程序
步驟1：用350μl 1X洗板緩沖液和
抽吸。預洗去除了微孔板穩(wěn)定劑，是實現(xiàn)均勻和宜反應(yīng)性的必要條件。
用倒置的微孔板或吸水毛巾墊上的條狀物*吸干。繼續(xù)罷工直到不行
液滴留在井里。添加樣品前，不要讓洗過的盤子*干燥。干燥
會對測試結(jié)果產(chǎn)生不利影響。
第二步：用準備好的標準配置兩條帶，如下所示。在
化驗。此井用于基板空白。用移液管將200微升的標準品1-6移到重復井和7（0 pg/ml）中。

第3步：用移液管將按照“試劑制備”一節(jié)所述制備的每個試樣200微升移到重復孔中。
第4步：用平板密封器覆蓋微孔板，并在37°C±1°C下培養(yǎng)至少1.5小時或過夜（多24小時）。
孵育時間短可能導致微板邊緣效應(yīng)。培養(yǎng)時間越長，敏感性越高。
步驟5：如步驟1所述，抽吸和清洗板6次。
步驟6：用移液管將100微升HIV-1 p24檢測抗體移入每個孔中，底物空白除外。用一個
在37°C±1°C下培養(yǎng)1小時。
步驟7：如步驟1所述，抽吸和清洗板6次。
第8步：用移液管將100微升基質(zhì)移入所有培養(yǎng)孔中，在室溫（18°-25°C）下培養(yǎng)30分鐘。一
在含有病毒抗原的井中會出現(xiàn)藍色。
第九步：用100微升停止液移液管將反應(yīng)停止。將導致顏色從藍色變?yōu)辄S色。
第10步：在15分鐘內(nèi)，用一個微板閱讀器在450納米處讀取每個孔的光密度。

計算和解釋結(jié)果
測試有效性：
•0.0 pg/ml標準的光密度不應(yīng)超過0.120。如果兩個或更多的井高于0.120，則測試
無效。
•125 pg/ml p24標準的光密度值應(yīng)大于1.100，否則試驗無效。
•測試樣品的平均吸光度讀數(shù)必須低于125 pg/ml，否則必須重新測試樣品。
在更高的稀釋度范圍內(nèi)。如果試樣的平均吸光度讀數(shù)低于
3.9 pg/ml，則p24濃度低于分析定量限值。

截止值的確定：
在0.0 pg/ml樣品光學值的平均值上添加0.030的預定系數(shù)。這是對
檢測化驗結(jié)果。該值是確定截止值的一般準則?；蛘?，更準確的結(jié)果可能
通過在一組已知的負樣品的平均光密度中添加至少兩個標準偏差來獲得。
樣本建立統(tǒng)計截止值。吸光度值大于或等于截止值但
低于3.9 pg/ml的平均吸光度值被認為是定性陽性。

要量化HIV-1 p24的水平：
計算每個p24標準品和試樣的平均吸光度。使用線性圖紙或計算機繪圖
軟件，在X軸上繪制HIV-1 p24抗原標準（pg/ml）的濃度與
Y軸上的每個標準。然后用插值法或線性法測定標本中HIV-1 p24抗原的濃度。
從標準曲線進行回歸分析。確保對所有稀釋進行校正，包括在
添加溶解緩沖液。供試品吸光度值必須在標準曲線內(nèi)才能準確定量。
病毒滴度（tu/ml）的測定：
慢病毒的每個物理粒子（pp）大約有2000個p24分子：
（2×103）
）x（24 x 103 da，每pp p24），48 x 106
/阿伏加德羅=（48 x 106
）/（6 x 1023）=8 x 10-17g P24/聚丙烯，大約
每1 x 10-16g P24 1 pp，每p24 1 x 104 pp。
一個包裝合理的VSV-G假型慢病毒載體的感染指數(shù)為每1000個單位1個單位。
物理粒子（pp）至1 tu/100 pp（或更小）。因此，p24的范圍約為10至100 tu/pg。
精度數(shù)據(jù)

資料
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